Qual é o melhor grau de DAISOGEL para a purificação de péptidos recombinantes?

Os péptidos recombinantes são terapêuticas produzidas a partir do método do ADN recombinante, uma técnica que permite a produção de péptidos muito mais longos e complexos. A produção começa com a fermentação utilizando um hospedeiro microbiano, como o microrganismo bacteriano E. coli, ou um microrganismo à base de levedura, como S. cerevisiae ou, mais recentemente, a metilotrófica Pichia pastoris.

Estes microrganismos são concebidos para expressar o péptido recombinante de interesse durante o processo de fermentação. Ao contrário do método sintético de produção de péptidos, o método recombinante produz uma quantidade significativa de resíduos de células hospedeiras, proteínas glicosiladas e outras impurezas que têm de ser removidas após a colheita. Além disso, os péptidos recombinantes são propensos a dimerização, agregação e fibrilhação. Por conseguinte, o processo de produção de recombinantes requer várias etapas de processamento a jusante - incluindo várias etapas de cromatografia - para atingir a pureza desejada. Não é invulgar que uma etapa de cromatografia de permuta iónica (IEX) e uma ou duas etapas de cromatografia de fase reversa (RPC) sejam implementadas na produção de GMP.

Purificação por cromatografia de fase reversa

Neste ponto, centrar-nos-emos nos passos da fase reversa. Há várias considerações a ter em conta na seleção da fase estacionária ideal para a purificação de péptidos recombinantes. O gel de sílica é o substrato mais comum 

utilizado para a purificação de péptidos em fase inversa devido à sua natureza robusta e capacidade de resolução comprovada; no entanto, nem todos os géis de sílica são criados da mesma forma. Um gel de sílica de fase reversa ideal deve contemplar
o seguinte: 

• Estabilidade alcalina: Uma vez que o material bruto está carregado com muitas impurezas diferentes, as colunas necessitam necessariamente de uma limpeza regular com agentes cáusticos entre ciclos. A CIP é um procedimento amplamente utilizado para remover os péptidos auto-agregados e fibrilhados do lado de entrada do leito de sílica da coluna. Este procedimento de regeneração tem de ser repetido periodicamente para manter a resolução, a separação dos picos e a baixa contrapressão da coluna, o que realça a necessidade de um gel de sílica que seja quimicamente compatível com condições alcalinas até 0,1M NaOH para limpeza.
• Capacidade de aglutinação: Esta é uma caraterística crítica para melhorar a economia da separação. Com uma maior capacidade de carga, é possível purificar uma maior quantidade de péptido recombinante em cada ciclo.
• Robustez mecânica: Em alguns casos, as colunas preparativas ou à escala de produção terão de
  ser desempacotadas e reempacotadas para melhorar a eficiência da coluna e prolongar a vida útil do meio. Isto exige um gel de sílica com elevada resistência mecânica para suportar múltiplos empacotamentos por compressão axial.

Uma nova fase estacionária concebida para a purificação de péptidos complexos

Anos de trabalho incansável de investigação e desenvolvimento na DAISOGEL levaram à conceção e fabrico da mais avançada fase estacionária à base de sílica para resolver estes desafios extraordinários, a que chamamos a Série PK. 

Com um tamanho de partícula de 10 µm para alta resolução e um tamanho de poro de 100 Å para maior capacidade de carga, também desenvolvemos a série PK com a nossa tecnologia avançada de modificação de superfície, resultando numa tolerância de pH imbatível em comparação com outras sílica gel de fase reversa no mercado. Além disso, a sua espinha dorsal de sílica especialmente concebida e fabricada proporciona uma resistência mecânica extra às partículas de sílica. Para testar as capacidades da Série PK em condições reais, realizámos um estudo de caso rigoroso de purificação de uma amostra de insulina bruta.

ESTUDO DE CASO: Aplicando a Série PK para Alcançar >99% de Pureza na Insulina Bruta

Nesta nota técnica, vamos demonstrar como a Série PK foi capaz de trazer uma alimentação de insulina bruta de apenas 72,5% de pureza e aumentar a pureza para mais de 99%. A pureza inicial da amostra bruta foi verificada por uma análise de HPLC analítica, como se pode ver abaixo.

Como se viu acima, a baixa qualidade da solução de alimentação em bruto tornou a modelação a jusante complicada. Uma etapa de cromatografia de troca catiónica forte baseada em polímeros bem executada (não mostrada) foi utilizada para aumentar a pureza do
para 88,0%. Para atingir a pureza final desejada, foram utilizados dois passos de RPC utilizando a série PK.

RPC Passo 1: gradiente ACN contra sulfato de amónio
/ ácido sulfúrico na série C8-PK

No primeiro passo da RPC, uma coluna DAISOGEL SP-100-10-C8-PK foi sobrecarregada com 15 g/L de insulina purificada por IEX. Com o objetivo de obter um rendimento de 90%, foi aplicado um gradiente de acetonitrilo contra um fundo de sulfato de amónio/ácido sulfúrico nas condições abaixo indicadas.

O pico de insulina foi recolhido e analisado. Os resultados analíticos de HPLC do pool RPC Step 1 indicam
que, com 90% de rendimento, foi obtida uma pureza de 97,0%, como se mostra abaixo.

RPC Passo 2: gradiente ACN contra acetato de amónio
/ ácido acético na série C8-PK

Para atingir a pureza >99,0% desejada, foi empregue um segundo passo de RPC. Uma coluna de preparação DAISOGEL SP-100-10-C8-PK foi sobrecarregada com 15 g/L de insulina purificada por RPC1. Com o mesmo objetivo de 90% de rendimento, foi aplicado um gradiente de acetonitrilo, mas desta vez contra um fundo de acetato de amónio/ácido acético, nas condições apresentadas abaixo.

O pico de insulina foi novamente recolhido e analisado. Os resultados analíticos de HPLC do pool RPC Step 2 indicam que, com 90% de rendimento, foi obtida com sucesso uma pureza de 99,7%, como se mostra abaixo. 

Conclusão

Os péptidos recombinantes são complexos por natureza e difíceis de purificar, sendo a insulina um exemplo clássico. Aumentar a pureza destes compostos para mais de 99%, sem sacrificar o rendimento, é importante tanto para a segurança do produto como por razões económicas. O gel de sílica DAISOGEL Série C8-PK foi selecionado para purificar um material de insulina bruta de baixa pureza devido à sua elevada área de superfície, capacidade de carga, resistência mecânica e poder de resolução. 

Ao empregar uma purificação RPC em duas etapas após uma etapa IEX, conseguimos alcançar com sucesso 99,7% de pureza sem sacrificar o rendimento.