¿Qué grado de DAISOGEL es el mejor para la purificación de péptidos recombinantes?

Los péptidos recombinantes son productos terapéuticos producidos a partir del método del ADN recombinante, una técnica que permite producir péptidos mucho más largos y complejos. La producción comienza con la fermentación utilizando un huésped microbiano, como el microorganismo bacteriano E. coli, o un microorganismo a base de levadura como S. cerevisiae o, más recientemente, la metilotrófica Pichia pastoris.

Estos microorganismos están diseñados para expresar el péptido recombinante de interés durante el proceso de fermentación. A diferencia del método sintético de producción de péptidos, el método recombinante produce una cantidad significativa de restos de células huésped, proteínas glicosiladas y otras impurezas que deben eliminarse tras la cosecha. Además, los péptidos recombinantes son propensos a la dimerización, agregación y fibrilación. Por lo tanto, el proceso de producción de recombinantes requiere múltiples pasos de procesamiento posterior -incluidos varios pasos de cromatografía- para lograr la pureza deseada. No es raro que en la producción GMP se aplique un paso de cromatografía de intercambio iónico (IEX) más uno o dos pasos de cromatografía de fase inversa (RPC).

Purificación por cromatografía en fase inversa

Aquí nos centraremos en los pasos de la fase inversa. Existen varias consideraciones a la hora de seleccionar la fase estacionaria ideal para la purificación de péptidos recombinantes. El gel de sílice es el sustrato más común 

utilizado para la purificación de péptidos en fase inversa debido a su naturaleza robusta y a su probada capacidad de resolución; sin embargo, no todos los geles de sílice son iguales. Un gel de sílice de fase inversa ideal debe contemplar
lo siguiente: 

• Estabilidad alcalina: Dado que el material bruto está cargado con muchas impurezas diferentes, las columnas requerirán necesariamente una limpieza regular con agentes cáusticos entre ciclos. El CIP es un procedimiento muy utilizado para eliminar los péptidos autoagregados y fibrilados del lado de entrada del lecho de sílice de la columna. Este procedimiento de regeneración debe repetirse periódicamente para mantener la resolución, la separación de picos y la baja contrapresión de la columna. Esto enfatiza la necesidad de un gel de sílice que sea químicamente compatible con condiciones alcalinas de hasta 0,1M de NaOH para la limpieza.
• Capacidad de aglutinación: Se trata de una característica crítica para mejorar la rentabilidad de la separación. Con una mayor capacidad de carga, se puede purificar una mayor cantidad de péptido recombinante en cada ciclo.
• Robustez mecánica: En algunos casos, las columnas preparativas o a escala de producción deberán
  desembalarse y volverse a embalar para mejorar la eficacia de la columna y prolongar la vida útil del medio. Esto requiere un gel de sílice con alta resistencia mecánica para soportar múltiples empaquetados por compresión axial.

Una nueva fase estacionaria diseñada para la purificación de péptidos complejos

Años de incesante trabajo de investigación y desarrollo en DAISOGEL condujeron al diseño y fabricación de la fase estacionaria basada en sílice más avanzada para resolver estos extraordinarios retos, que denominamos Serie PK. 

Con un tamaño de partícula de 10 µm para una alta resolución y un tamaño de poro de 100 Å para una mejor capacidad de carga, también hemos desarrollado la serie PK con nuestra avanzada tecnología de modificación de la superficie, lo que da como resultado una tolerancia al pH insuperable en comparación con otros geles de sílice de fase inversa del mercado. Además, su columna vertebral de sílice especialmente diseñada y fabricada proporciona una resistencia mecánica adicional a las partículas de sílice. Para probar las capacidades de PK Series en condiciones reales, realizamos un riguroso estudio de caso purificando una muestra de insulina cruda.

ESTUDIO DE CASO: Aplicación de las series PK para lograr una pureza superior al 99% en la insulina cruda

En esta nota técnica demostraremos cómo la Serie PK fue capaz de llevar una alimentación de insulina cruda de sólo el 72,5% de pureza y elevar la pureza a más del 99%. La pureza inicial de la muestra cruda se verificó mediante un análisis HPLC analítico, como se ve a continuación.

Como ya se ha visto, la baja calidad de la solución de alimentación bruta dificultó la modelización posterior. Se utilizó una etapa de cromatografía de intercambio catiónico fuerte basada en polímeros (no mostrada) para aumentar la pureza de
hasta el 88,0%. Para alcanzar la pureza final deseada, se emplearon dos etapas de RPC con PK Series.

RPC Paso 1: gradiente ACN contra sulfato de amonio
/ ácido sulfúrico en la serie C8-PK

En el primer paso RPC, se sobrecargó una columna DAISOGEL SP-100-10-C8-PK preparada con 15 g/L de insulina purificada con IEX. Con el objetivo de obtener un rendimiento del 90%, se aplicó un gradiente de acetonitrilo sobre un fondo de sulfato de amonio/ácido sulfúrico en las condiciones que se muestran a continuación.

Se recogió y analizó el pico de insulina. Los resultados analíticos de HPLC del pool RPC Paso 1 indican
que con un rendimiento del 90%, se obtuvo una pureza del 97,0%, como se muestra a continuación.

RPC Paso 2: Gradiente ACN contra acetato de amonio
/ ácido acético en la serie C8-PK

Para conseguir la pureza deseada >99,0%, se empleó un segundo paso de RPC. Se sobrecargó una columna DAISOGEL SP-100-10-C8-PK preparada con 15 g/L de insulina purificada con RPC1. Con el mismo objetivo de 90% de rendimiento, se aplicó un gradiente de acetonitrilo, pero esta vez contra un fondo de acetato de amonio / ácido acético, bajo las condiciones que se muestran a continuación.

El pico de insulina se recogió de nuevo y se analizó. Los resultados analíticos de HPLC del pool de RPC Paso 2 indican que con un rendimiento del 90%, se obtuvo con éxito una pureza del 99,7%, como se muestra a continuación. 

Conclusión

Los péptidos recombinantes son complejos por naturaleza y difíciles de purificar; la insulina es un ejemplo clásico. Llevar la pureza de estos compuestos a más del 99% sin sacrificar el rendimiento es importante tanto por la seguridad del producto como por razones económicas. El gel de sílice DAISOGEL de la serie C8-PK fue seleccionado para purificar un material de insulina cruda de baja pureza debido a su elevada área superficial, capacidad de carga, resistencia mecánica y poder de resolución. 

Empleando una purificación RPC en dos pasos después de un paso IEX, pudimos lograr con éxito una pureza del 99,7% sin sacrificar el rendimiento.