Mesmo as colunas bem embaladas perderão alguma da sua eficiência durante longos períodos de utilização de muitos ciclos, especialmente quando utilizadas com amostras de elevado nível de impureza. Se a sua coluna for utilizada para a purificação de péptidos sintéticos ou de péptidos recombinantes ou, no pior dos casos, para a purificação de péptidos agregados e fibrilhados, o desempenho da coluna pode diminuir rapidamente.
O primeiro sinal de aviso é normalmente o aumento da contrapressão da coluna. A deterioração da forma do pico ou a diminuição do número de placas teóricas pode ser outro sinal de que é necessário limpar o péptido fibrilado que se acumula no lado de entrada do leito de sílica da coluna.
Dica útil: efetuar a etapa de lavagem com fluxo invertido. Não quer que o lixo passe pela coluna!
A sua fase estacionária é um investimento dispendioso, por isso, como pode prolongar a sua vida útil ou regenerar a sua coluna embalada que começou a degradar-se em termos de desempenho?
Como primeiro passo, lavar a coluna com solvente orgânico a 90-100 % nunca é prejudicial e este simples passo ajuda muitas vezes! Dica útil: efectue o passo de lavagem com fluxo invertido. Não quer que o lixo se desloque através da coluna!
Que solvente deve ser utilizado para as regenerações?
Os péptidos interagem normalmente com a sílica através de múltiplas interacções: interacções hidrofóbicas, interacções electrostáticas silanofílicas, ligações de hidrogénio, etc. Por conseguinte, é fundamentalmente importante suprimir TODAS as interacções para uma regeneração bem sucedida da coluna. É igualmente importante suprimir as interacções intermoleculares entre péptidos e péptidos.
A ureia, o hidróxido de amónio e o Tris são agentes bem conhecidos para suprimir as interacções entre péptidos. O Tris
(10 mM, pH = 9-10) é um excelente agente para evitar a agregação de péptidos e para os dissolver. E, claro, o pH também terá um grande impacto na supressão e na dissolução. O pH adequado a utilizar é difícil de prever e depende em grande medida do ponto isoelétrico do péptido.
Geralmente, são necessários cerca de 50-60% de solvente orgânico para suprimir as interacções hidrofóbicas e catiões (por exemplo, amónio, sódio, aminas) para suprimir as interacções silanofílicas.
Esta é a chave para permitir a degradação das impurezas bloqueadas; o desacoplamento da agregação combinado com o efeito de dessorção do solvente orgânico, que transporta os fragmentos de fibrilas peptídicas desacopladas. Esta é a "dupla ação" necessária para uma limpeza bem sucedida da coluna e ajudará a prolongar a sua vida útil.
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