哪种 DAISOGEL 等级最适合重组多肽纯化？

重组肽是用 DNA 重组法生产的治疗药物，这种技术可以生产更长、更复杂的肽。生产首先使用微生物宿主进行发酵，如细菌微生物大肠杆菌或酵母微生物，如酿酒酵母，或最近使用的养甲菌 Pichia pastoris。

这些微生物经过改造，可在发酵过程中表达所需的重组肽。与合成法生产多肽不同，重组法会产生大量宿主细胞碎片、糖基化蛋白质和其他杂质，必须在收获后清除。此外，重组肽容易发生二聚化、聚集和纤维化。因此，重组肽的生产过程需要多个下游处理步骤，包括多个层析步骤，才能达到理想的纯度。在 GMP 生产中，通常会采用一个离子交换色谱 (IEX) 步骤和一到两个反相色谱 (RPC) 步骤。

反相色谱法纯化

在此，我们将重点介绍反相步骤。在选择用于重组肽纯化的理想固定相时，有几个注意事项。硅胶是最常用的基质 

然而，并不是所有的硅胶都是一样的。理想的反相硅胶应考虑
以下几点： 

• 碱性稳定性：碱性稳定性：由于粗制材料中含有许多不同的杂质，因此色谱柱在两次循环之间必须定期使用苛性碱进行清洗。CIP 是一种广泛使用的程序，用于清除色谱柱硅胶床入口侧自聚集的纤维肽。这种再生程序必须定期重复，以保持分辨率、峰的分离和低柱背压。
• 结合能力：这是提高分离经济性的关键特性。负载能力越高，每次循环可纯化的重组肽就越多。
• 机械坚固性：在某些情况下，制备或生产规模的色谱柱需要
  拆开并重新装柱，以提高色谱柱的效率并延长介质的使用寿命。这就需要硅胶具有较高的机械强度，以承受多次轴向压缩填料。

专为复杂多肽纯化设计的新型固定相

DAISOGEL 经过多年不懈的研发工作，设计并制造出了最先进的硅胶固定相，以解决这些非同寻常的挑战，我们称之为PK 系列。 

我们还利用先进的表面改性技术开发了 PK 系列，与市场上的其他反相硅胶相比，它具有无与伦比的 pH 耐受性。此外，其专门设计和制造的硅胶骨架为硅胶颗粒提供了额外的机械强度。为了测试 PK 系列在实际条件下的能力，我们进行了一项严格的案例研究，对粗制胰岛素样品进行纯化。

案例研究：应用 PK 系列使粗胰岛素纯度达到 >99

在本技术说明中，我们将展示 PK 系列是如何将纯度仅为 72.5% 的粗胰岛素原料提高到 99% 以上的。粗样品的初始纯度是通过 HPLC 分析验证的，如下所示。

如上所述，粗进料溶液的低质量使得下游建模工作十分棘手。为了将
的纯度提高到 88.0%，采用了一个执行良好的聚合物强阳离子交换色谱步骤（未显示）。为了达到最终所需的纯度，采用了两个使用 PK 系列的 RPC 步骤。

RPC 步骤 1：在 C8-PK 系列上用 ACN 梯度对
硫酸铵/硫酸进行梯度处理

在第一个 RPC 步骤中，预处理 DAISOGEL SP-100-10-C8-PK 色谱柱过载 15 克/升的 IEX 纯化胰岛素。以 90% 的收率为目标，在硫酸铵/硫酸背景下使用乙腈梯度，条件如下。

收集并分析胰岛素峰。RPC 第 1 步池的 HPLC 分析结果显示
，收率为 90%，纯度为 97.0%，如下图所示。

RPC 步骤 2：C8-PK 系列上的 ACN 梯度对
乙酸铵/醋酸

为了达到所需的大于 99.0% 的纯度，采用了第二个 RPC 步骤。在预处理 DAISOGEL SP-100-10-C8-PK 色谱柱上过载 15 克/升的 RPC1 纯化胰岛素。同样以 90% 的收率为目标，采用乙腈梯度，但这次以乙酸铵/乙酸为背景，条件如下。

再次收集并分析胰岛素峰。RPC 第 2 步池的高效液相色谱分析结果表明，胰岛素的收率为 90%，纯度为 99.7%，如下图所示。 

结论

重组肽性质复杂，纯化难度大，胰岛素就是一个典型的例子。将此类化合物的纯度提高到 99% 以上，同时不牺牲产量，这对于产品安全和经济效益都非常重要。DAISOGEL C8-PK 系列硅胶具有高比表面积、可负载性、机械强度和分辨能力，因此被选为纯化低纯度胰岛素粗品的材料。 

通过在 IEX 步骤之后采用两步 RPC 纯化，我们成功地实现了 99.7% 的纯度，同时不影响产量。