Welche DAISOGEL-Sorte eignet sich am besten für die Aufreinigung rekombinanter Peptide?

Rekombinante Peptide sind Therapeutika, die mit Hilfe der rekombinanten DNA-Methode hergestellt werden, einer Technik, mit der sehr viel längere und komplexere Peptide produziert werden können. Die Produktion beginnt mit der Fermentation in einem mikrobiellen Wirt, z. B. dem bakteriellen Mikroorganismus E. coli oder einem Mikroorganismus auf Hefebasis wie S. cerevisiae oder neuerdings der methylotrophen Pichia pastoris.

Diese Mikroorganismen sind so konstruiert, dass sie das gewünschte rekombinante Peptid während des Fermentationsprozesses exprimieren. Im Gegensatz zur synthetischen Methode der Peptidproduktion fällt bei der rekombinanten Methode eine erhebliche Menge an Wirtszelltrümmern, glykosylierten Proteinen und anderen Verunreinigungen an, die nach der Ernte entfernt werden müssen. Darüber hinaus neigen rekombinante Peptide zur Dimerisierung, Aggregation und Fibrillierung. Daher erfordert der rekombinante Produktionsprozess mehrere Schritte der nachgeschalteten Verarbeitung - einschließlich mehrerer Chromatographieschritte -, um die gewünschte Reinheit zu erreichen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass in der GMP-Produktion ein Ionenaustauschchromatographieschritt (IEX) und ein oder zwei Umkehrphasenchromatographieschritte (RPC) durchgeführt werden.

Reinigung durch Umkehrphasenchromatographie

Hier konzentrieren wir uns auf die Reversed-Phase-Schritte. Bei der Auswahl der idealen stationären Phase für die Reinigung rekombinanter Peptide gibt es mehrere Überlegungen. Kieselgel ist das am häufigsten verwendete Substrat 

aufgrund seiner Robustheit und seines bewährten Auflösungsvermögens für die Umkehrphasen-Peptidreinigung verwendet; allerdings sind nicht alle Kieselgele gleich. Ein ideales Umkehrphasen-Kieselgel sollte Folgendes berücksichtigen:
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• Alkalische Stabilität: Da das Rohmaterial mit vielen verschiedenen Verunreinigungen belastet ist, müssen die Säulen zwischen den Zyklen regelmäßig mit Laugen gereinigt werden. CIP ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Entfernung selbstaggregierter, fibrillierter Peptide von der Einlassseite des Siliziumdioxidbetts in der Säule. Dieses Regenerationsverfahren muss regelmäßig wiederholt werden, um die Auflösung, die Auftrennung der Peaks und einen niedrigen Säulengegendruck aufrechtzuerhalten. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines Kieselgels, das chemisch mit alkalischen Bedingungen von bis zu 0,1 M NaOH zur Reinigung kompatibel ist.
• Bindekapazität: Dies ist ein entscheidendes Merkmal zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Auftrennung. Mit einer höheren Beladbarkeit kann in jedem Zyklus eine größere Menge an rekombinantem Peptid gereinigt werden.
• Mechanische Robustheit: In einigen Fällen müssen die Säulen im Präparations- oder Produktionsmaßstab
  ausgepackt und neu gepackt werden, um die Effizienz der Säule zu verbessern und die Lebensdauer des Mediums zu verlängern. Hierfür ist ein Kieselgel mit hoher mechanischer Festigkeit erforderlich, das mehreren axialen Druckpackungen standhält.

Eine neue stationäre Phase für die Aufreinigung komplexer Peptide

Jahrelange unermüdliche Forschungs- und Entwicklungsarbeit bei DAISOGEL führte zur Entwicklung und Herstellung der fortschrittlichsten stationären Phase auf Siliziumdioxidbasis, um diese außergewöhnlichen Herausforderungen zu lösen, die wir die PK-Serie nennen. 

Mit einer Partikelgröße von 10 µm für eine hohe Auflösung und einer Porengröße von 100 Å für eine verbesserte Beladbarkeit haben wir die PK-Serie auch mit unserer fortschrittlichen Oberflächenmodifikationstechnologie entwickelt, die zu einer unschlagbaren pH-Toleranz im Vergleich zu anderen Umkehrphasen-Kieselgelen auf dem Markt führt. Darüber hinaus sorgt das speziell entwickelte und hergestellte Silica-Grundgerüst für die zusätzliche mechanische Festigkeit der Silica-Partikel. Um die Fähigkeiten der PK-Serie unter realen Bedingungen zu testen, haben wir eine strenge Fallstudie zur Reinigung einer rohen Insulinprobe durchgeführt.

FALLSTUDIE: Anwendung von PK-Serien zur Erzielung einer Reinheit von >99% bei Rohinsulin

In dieser technischen Notiz zeigen wir, wie die PK-Serie in der Lage war, ein Rohinsulin mit einem Reinheitsgrad von nur 72,5 % zu gewinnen und den Reinheitsgrad auf über 99 % zu erhöhen. Die anfängliche Reinheit der Rohprobe wurde durch eine analytische HPLC-Analyse überprüft, wie unten zu sehen ist.

Wie bereits erwähnt, machte die geringe Qualität der rohen Ausgangslösung die nachgeschaltete Modellierung schwierig. Ein gut ausgeführter Polymer-basierter starker Kationenaustausch-Chromatographieschritt (nicht gezeigt) wurde verwendet, um die Reinheit von
auf 88,0 % zu erhöhen. Um die gewünschte Endreinheit zu erreichen, wurden zwei RPC-Schritte mit der PK-Serie durchgeführt.

RPC Schritt 1: ACN-Gradient gegen Ammonium
sulfat / Schwefelsäure auf C8-PK Serie

Im ersten RPC-Schritt wurde eine prep DAISOGEL SP-100-10-C8-PK-Säule mit 15 g/L IEX-gereinigtem Insulin überladen. Mit dem Ziel einer Ausbeute von 90 % wurde ein Acetonitril-Gradient vor einem Hintergrund aus Ammoniumsulfat/Schwefelsäure unter den unten dargestellten Bedingungen angewendet.

Der Insulinpeak wurde gesammelt und analysiert. Die analytischen HPLC-Ergebnisse aus dem RPC-Pool der Stufe 1 zeigen
, dass bei einer Ausbeute von 90 % eine Reinheit von 97,0 % erzielt wurde, wie unten dargestellt.

RPC Schritt 2: ACN-Gradient gegen Ammonium
acetat / Essigsäure auf C8-PK Serie

Um die gewünschte Reinheit von >99,0 % zu erreichen, wurde ein zweiter RPC-Schritt durchgeführt. Eine prep DAISOGEL SP-100-10-C8-PK-Säule wurde mit 15 g/L RPC1-gereinigtem Insulin überladen. Mit dem gleichen Ziel von 90 % Ausbeute wurde ein Acetonitril-Gradient angewandt, diesmal jedoch vor dem Hintergrund von Ammoniumacetat/Essigsäure und unter den unten dargestellten Bedingungen.

Der Insulinpeak wurde erneut gesammelt und analysiert. Die analytischen HPLC-Ergebnisse aus dem RPC-Pool der Stufe 2 zeigen, dass bei einer Ausbeute von 90 % eine Reinheit von 99,7 % erzielt wurde, wie unten dargestellt. 

Schlussfolgerung

Rekombinante Peptide sind von Natur aus komplex und schwierig zu reinigen, wobei Insulin ein klassisches Beispiel darstellt. Es ist sowohl aus Gründen der Produktsicherheit als auch aus wirtschaftlichen Gründen wichtig, die Reinheit solcher Verbindungen auf über 99 % zu erhöhen, ohne dabei die Ausbeute zu beeinträchtigen. Das Kieselgel der Serie DAISOGEL C8-PK wurde aufgrund seiner hohen Oberfläche, Belastbarkeit, mechanischen Festigkeit und seines Auflösungsvermögens für die Aufreinigung eines rohen Insulinmaterials mit geringer Reinheit ausgewählt. 

Durch eine zweistufige RPC-Reinigung nach einem IEX-Schritt konnten wir eine Reinheit von 99,7 % erreichen, ohne die Ausbeute zu beeinträchtigen.