Selbst gut gepackte Säulen verlieren im Laufe einer langen Nutzungsdauer von vielen Zyklen einen Teil ihrer Effizienz, insbesondere wenn sie mit Proben mit hohem Verunreinigungsgrad verwendet werden. Wenn Ihre Säule für die Aufreinigung synthetischer oder rekombinanter Peptide oder im schlimmsten Fall für die Aufreinigung aggregierender, fibrillierender Peptide verwendet wird, kann die Leistung der Säule recht schnell abnehmen.
Das erste Warnzeichen ist in der Regel der steigende Gegendruck der Säule. Die Verschlechterung der Peakform oder der Rückgang der Anzahl theoretischer Böden kann ein weiteres Anzeichen dafür sein, dass Sie das fibrillierte Peptid, das sich auf der Einlassseite des Siliziumdioxidbettes in Ihrer Säule gebildet hat, entfernen müssen.
Nützlicher Tipp: Führen Sie den Waschschritt mit umgekehrtem Fluss durch. Sie wollen nicht, dass der Müll durch die Säule wandert!
Ihre stationäre Phase ist eine teure Investition. Wie können Sie also ihre Lebensdauer verlängern oder Ihre gepackte Säule, deren Leistung nachlässt, regenerieren?
Als erster Schritt ist das Waschen der Säule mit 90 - 100 % organischem Lösungsmittel nie schädlich, und dieser einfache Schritt hilft oft! Nützlicher Tipp: Führen Sie den Waschschritt mit umgekehrtem Fluss durch. Sie wollen nicht, dass der Müll durch die Säule wandert!
Welches Lösungsmittel sollte für Regenerierungen verwendet werden?
Peptide interagieren in der Regel durch mehrere Wechselwirkungen mit Silika: hydrophobe, silanophile, elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, usw. Daher ist es für eine erfolgreiche Säulenregeneration von grundlegender Bedeutung, ALLE Wechselwirkungen zu unterdrücken. Es ist auch wichtig, intermolekulare Peptid-Peptid-Wechselwirkungen zu unterdrücken.
Harnstoff, Ammoniumhydroxid und Tris sind bekannte Mittel zur Unterdrückung von Peptid-Wechselwirkungen. Tris
(10 mM, pH = 9-10) ist ein hervorragendes Mittel, um die Aggregation von Peptiden zu verhindern und sie aufzulösen. Und natürlich hat auch der pH-Wert einen großen Einfluss auf die Unterdrückung und Auflösung. Der richtige pH-Wert lässt sich nur schwer vorhersagen und hängt weitgehend vom isoelektrischen Punkt des Peptids ab.
Im Allgemeinen benötigen Sie etwa 50-60 % organisches Lösungsmittel, um die hydrophoben Wechselwirkungen zu unterdrücken, und Sie benötigen Kationen (z. B. Ammonium, Natrium, Amine), um silanophile Wechselwirkungen zu unterdrücken.
Dies ist der Schlüssel für den Abbau der festsitzenden Verunreinigungen: die Auflösung der Aggregation in Verbindung mit dem Desorptionseffekt des organischen Lösungsmittels, der die gelösten Peptidfibrillenfragmente abtransportiert. Dies ist die notwendige "Doppelwirkung" für eine erfolgreiche Säulenreinigung und wird dazu beitragen, die Lebensdauer Ihrer Säule zu verlängern.
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